紅細胞壽命測定與血液病的精準診斷
發布時間：2017-02-04 17:13 作者：無 點擊：
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精準醫療的目的是精準治療，精準治療的前提是針對分子靶點的精確診斷分型。目前國際上白血病診斷通用的是細胞形態學（Morphology）、免疫學（Immunology）、細胞遺傳學（Cytogenetics）和分子生物學（Molecular biology）分型，即我們常說的MICM分型方法。
隨著分子診斷技術的日益發展和白血病分子標志物被發現，各種先進的分子診斷技術已應用于白血病診斷領域，白血病的診斷已從過去以形態為主的診斷體系，正逐步向以精確分子診斷為核心的個體化診斷體系發展。隨著細胞遺傳學、流式細胞術免疫表型分析和第2代測序技術等新的診斷技術在臨床的推廣應用，血液病進入一個精確診斷時代。這些技術在白血病的診斷、微小殘留病的監測、預后判斷及靶向治療等方面發揮了重要的作用，有些已成為臨床必需的常規檢測項目。正確解讀這些新興的診斷技術及方法，可指導臨床醫生合理、優化及針對患者量身定做找到每一個白血病發病原因及治療方法。
先亞生物科技研發的紅細胞壽命測定儀檢測的原理
應用放射性核素在體內或體外標記紅細胞，并觀察這些標記的紅細胞中的放射性消失的速率，從而獲得紅細胞每天死亡的百分數或稱紅細胞更新的查分數，則100%更新所需的時間為紅細胞壽命期，另外也可利用放射性核素參加紅細胞生成，測定放射性在紅細胞中消失時間，而求得紅細胞壽命。目前常用的示蹤劑為51鉻酸鈉及氟32磷酸二異丙酯：用放射性鐵測定紅細胞壽命，正常人紅細胞壽命為100～130天，平均125天左右，此外應用51鉻標記紅細胞在循環血液中減少50%，即T50半衰期作為臨床指標，此法較簡便，正常人為25～40天，20天以下為縮短，17天以下為明顯縮短，溶血性貧血患者紅細胞壽命明顯縮短，如鐮狀紅細胞性貧血縮短至5～15天，陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）縮短至10天左右。本試驗對研究和診斷溶血性貧血是一個重要方法，通過分析紅細胞壽命縮短的原因，可確認是由于紅細胞自身缺陷而致紅細胞壽命縮短，還是由于患者體內某些外界因素而致細胞壽命縮短，而患者本身紅細胞是正常的。真性紅細胞增多癥紅細胞壽命延長。
一、 細胞與分子遺傳學檢測
1. 熒光原位雜交（fluorescece in situ hybridization，FISH）：是臨床上的常規檢測方法,是檢測融合基因的金標準方法。比常規的染色體核型分析要方便、準確和快速，它可檢出一些常規染色體核型分析不易發現或有不明來源的標志染色體?？蓹z測平衡易位和微缺失；用于快速診斷、分類、治療。
2. 多色熒光原位雜交（multiplex-FISH,M-FISH）,多用以確定微小的染色體易位、來源不明的標記染色體和隱匿的染色體異位。其獨特的優勢在于可一次性分辨全部人類染色體，適用于復雜異常核型的診斷、風險分類和預后判斷，主要用于初發和復發病例的檢測。但其無法檢測同一條染色體中的易位或倒位、小片段缺失和重復等異常，也不能精確地顯示染色體斷裂的區帶，且靈敏度不及PCR，因此具有一定的局限性。另外，由于費用昂貴，目前尚未普及開展。
3. 微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）。在全基因組水平上檢測白血病基因組DNA序列的拷貝數變異。有較高的分辨率，可找到染色體核型分析難以發現的不同染色體上可能的斷裂點和具體的位點。在鑒定慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者微小基因片段重復或丟失的染色體異常，也可用于與治療相關AML患者的基因分層。還可以發現因藥物治療相關的白血病而導致一些重要微小染色體區域的異常。因其不能檢測出平衡易位，且對于異常細胞比例少或有丟失片段方面存在漏檢。目前CGH和 aCGH 尚未成為臨床應用的常規檢查之一。
4. SNP芯片：具有高通量性特點，在鑒別白血病是否發生復發突變或克隆演變方面具有較好的臨床價值；在全基因組水平檢測與白血病發生發展、療效和預后相關的SNP位點。目前，已有商業化SNP芯片供應，隨著技術成熟和檢測成本下降，SNP芯片將會成為篩查常規項目。
二、 微小殘留白血病檢測
微小殘留白血?。╩inimal residualdisease，MRD）是白血病復發的根源，首選檢測標本為骨髓，其次為外周血。目前已用于檢測MDR的技術主要有流式細胞術（FCM）和PCR技術，PCR技術是比FCM方法更敏感地檢出MDR，敏感性都可達到10-5~10-3（即105~103細胞中有1個腫瘤細胞）以上。
1. 多重RT-n-PCR和多重熒光PCR方法：PCR是檢測染色體易位的首選方法。二者是臨床上常用的融合基因定性檢測方法?？赏瑫r檢測已知的多種融合基因及剪切體。臨床醫生可選擇AML 16種常見融合基因、ALL 15種常見融合基因或白血病31種融合基因等組合篩查融合基因。而后者可在熒光定量PCR儀上直接判讀結結果。 目前該技術已逐漸被逆轉錄實時熒光定量PCR所取代。
2. 逆轉錄實時熒光定量PCR （reverse-tranion quantitative real-time PCR，RT-qPCR）：目前已作為檢測融合基因的常規方法。基于TaqMan 探針原理的RT-qPCR是目前最為理想的MRD 定量檢測方法。具有敏感度高、準確定量、簡便快速，污染較少等優點?？捎糜诎籽〉脑\斷、分型、ＭＲＤ監測和預后判斷。且已有商業化的試劑盒可利用。有資質的醫療單位或實驗室都能開展此項目。
3. 數字PCR：是基于單分子PCR方法的核酸靶分子定量檢測手段，具有高靈敏度的特點。但檢測成本高，目前還不適合于臨床常規推廣。
三、 基因突變檢測
50%以上的白血病缺乏特征性的細胞遺傳學變化，而是是多種基因突變積累的結果。目前基因突變已作為白血病的更精確地診斷分型、危險分層，個體化治療、靶向治療及評估預后轉歸的主要分子標志。例如WHO分類已將AML伴CEBPA突變和AML伴NPM1突變作為一種AML的特殊亞型。白血病較常見突變基因有JAK2、MPL、NPM1、CEBPA、FLT3、C-KIT、N-RAS、WT1、HOX11、ASXL1、DNMT3A、MLL、IDN1、IDH2和TET2等。因此高效、精準的基因突變篩查方法至關重要。
1. 直接測序法（Sanger法）：是基因測序的金標準方法，可分析未知突變。單向測序讀長達500～1000bp, 但只能測定２０％以上的突變。由于通量小，速度慢，已逐漸被其他高靈敏方法所替代或并用。
2. 焦磷酸測序（Pyrosequencing）：適于已知的短序列的測序分析，具有可重復性、快速，能檢測低至５％的突變及報告突變頻率。精確性與Sanger相似，適用已知突變位點檢測，用于白血病的分類和MRD監測。
3. 高通量測序又名下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）：是現今應用最廣泛的高通量測序技術，是大規模平行測序。具有極高靈敏性，可在一個測試反應中檢測點突變、缺失、插入、染色體平衡易位及鑒定白血病特異的融合基因等多種異常。其檢測結果可以對臨床醫生治療方案的制定、患者預后的評估提供精準、有效的信息?？捎糜诨谕蛔儥z測的MRD分析;也可用于部分白血病發病機制的研究。由于費用問題，在臨床上尚未大規模開展?；诖髷祿脚_的測序結果解讀、注釋的合作，可獲得“1+1>2”的成果。隨著檢測成本的降低，將會在臨床推廣。
四、 基因表達譜檢測
基因表達譜（gene expression profiling，GEF）：cDNA芯片具有集傳統細胞遺傳學、點突變分析、基因表達分析于一身的功能，已經用于白血病GEF分析。其優越性為能夠在基因表達水平上對白血病進行更精確的分型分類，從而提高治療的針對性。預測白血病的治療效果和預后，在探索白血病的病因和機制診斷、功能相關基因、新的治療靶基因等方面發揮重要的作用。不過，敏感度和特異度差，限制其臨床應用。
精準醫療呼喚著與此相適應的精準診斷，臨床醫生根據患者病情，正確評估形態學、免疫、細胞遺傳學及分子生物學的作用；合理檢查、精準診斷及分型、個體化治療、正確評估預后及風險分層，做使患者從精準醫療中獲得更多好處。
